Menyiapkan vektor dan insert untuk DNA rekombinan baru


Untuk membuat konstruksi plasmid rekombinan yang baru, biasanya kita menyiapkan vektor (plasmid) dan insert (gene of your interest). Agar insert ini bisa masuk dan menyisip ke dalam vektor pada posisi dan orientasi yang benar, maka perlu dilakukan pemotongan dengan enzim restriksi. Enzim restriksi bisa menghasilkan dua macam potongan, yaitu ujung tumpul (blunt end) dan cohesive/sticky end (ujung kohesif). Ujung potongan yang kohesif sangat menguntungkan karena pasangan insert dan vekor akan dapat diligasi jiga dipotong dengan enzim restriksi yang sama. Sedangkan ujung tumpul akan dapat menempel dengan ujung tumpul lainnya yang tidak spesifik.

Misalnya, jika vektor kita potong dengan enzim HindIII dan XbaI, maka insert juga kita potong dengan enzim yang sama. Maka secara otomatis, ujung kohesif yang dihasilkan HindIII pada vektor akan tersambung pada ujung kohesif HindIII insert. Dengan demikian, orientasi insert akan searah dengan ORI (origin replication) sehingga dapat diekspresikan.

Agar bisa melakukan reaksi ligasi dengan baik, maka perlu dilakukan purifikasi vektor maupun insert, agar tidak terkontaminasi dengan fragmen-fragmen DNA yang lain. Oleh karena itu, biasanya vektor yang telah dipotong di-run pada gel agarosa, dan diisolasi fragmen yang diinginkan dari gel. Selanjutnya, fragmen tersebut dapat diambil kembali dengan mudah dengan menggunakan serbuk silika (glass beads method). Sedangkan untuk insert yang biasanya disiapkan dengan amplifikasi terlebih dahulu (PCR), seyogyanya dilakukan purifikasi dari gel terlebih dahulu sebelum dilakukan digesti enzim. Hal ini dikarenakan campuran reaksi PCR juga mengandung primer-primer yang memiliki sisi restriksi enzim sehingga akan menghambat kerja enzim. Ini dapat mengakibatkan pemotongan yang tidak sempurna oleh enzim. Setelah dilakukan purifikasi, selanjutnya didigesti, dan tinggal dilakukan pemurnian dengan ekstraksi fenol-kloroform saja (tidak perlu isolasi dari lagi dari gel).

Perlu diingat, bahwa untuk kerja molekuler ini perlu dilakukan dengan bersih agar terbebas dari kontaminan maupun kemungkinan-kemungkinan yang dapat merusak DNA, maka sebaiknya digunakan gel agarosa dan running buffer (TAE) yang baru. Selain menggunakan skalpel (pisau pemotong gel) yang bersih, jangan menyentuhkan gel pada permukaan-permukaan yang kotor, semisal transilluminator (alasi dengan saran wrap/cling wrap), sarung tangan yang kotor, atau wadah yang tidak bersih, dll.

Singkatnya, untuk preparasi:

– vektor: vektor murni dari midi/maksi prep –> digesti –> isolasi dari gel –> penetapan konsentrasi –> ligasi

– insert: amplifikasi –> isolasi dari gel –> digesti –> ekstraksi fenol-kloroform –> penetapan konsentrasi –> ligasi

Sebelum melakukan reaksi ligasi, diperlukan penetapan konsentrasi DNA vektor maupun insert, karena perbandingan yang tidak sesuai dapat menyebabkan hasil yang tidak diinginkan. Pada umumnya vektor berukuran lebih besar daripada insert. Semisal, vektor 6kb, dan insert 0,3kb, maka kita bisa menggunakan perbandingan vektor:insert = 1:3 agar insert lebih mudah menyisip ke vektor. Jadi untuk reaksi ligasi bisa kita gunakan 60 ng vektor dan 3×3 ng insert (atau dibulatkan 10 ng), atau untuk reaksi yang lebih kecil, dengan 30 ng vektor dan 5 ng insert. Untuk bisa memperhitungkan berapa jumlah larutan DNA yang diperlukan, maka perlu dilakukan penetapan konsentrasi DNA. Metode UV-spektrofotometri memerlukan jumlah sampel yang cukup besar, sehingga untuk menghemat sampel, bisa dilakukan spot test. Perlu diingat bahwa jangan menambahkan terlalu banyak insert agar tidak terjadi konstruksi yang aneh.

Hal lain yang perlu diperhatikan saat melakukan ligasi adalah jumlah enzim T4 ligase yang ditambahkan. Enzim ini adalah enzim yang sangat kuat, oleh karenanya jangan menambahkan terlalu banyak enzim ini. Biasanya, stok komersial enzim ligase mengandung enzim dengan konsentrasi yang tinggi (400,000 unit/ml-2,000,000 unit/ml) sehingga untuk sekali reaksi cukup dengan menambahkan sekitar 0.1-0.3 ul stok enzim. Selain harganya yang mahal (pemborosan), enzim yang terlalu banyak akan menghasilkan reaksi-reaksi ligasi sampingan yang tidak perlu.

(Xept-2010; dengan saran-saran dari Kawaichi sensei)

Are you ready to cut the bands?

are-you-ready-to-cut-the-band

I am so phobia with this UV-transilluminator because it remains me about my experiment when I have to cut the bands in the agarose gel. I only have 10 seconds to keep the DNA from the damaging UV. So, I have to be ready to see the bands, recognize the band of interest, and cut it, all in only 10 seconds. Fiuuh..with mask, and no convenience gloves..it is very terrible. I always hope that my experiment is the last one. Unfortunately, I usually have to repeat the experiment for the second or third times (Xept-2009, at Kawaichi ken).

Advertisements

Leave a Reply

Fill in your details below or click an icon to log in:

WordPress.com Logo

You are commenting using your WordPress.com account. Log Out / Change )

Twitter picture

You are commenting using your Twitter account. Log Out / Change )

Facebook photo

You are commenting using your Facebook account. Log Out / Change )

Google+ photo

You are commenting using your Google+ account. Log Out / Change )

Connecting to %s

%d bloggers like this: