PREPARASI PLASMID SKALA SEDANG DENGAN QIAGEN MIDI KIT


A. Preparasi Kultur Bakteri untuk Isolasi Plasmid Skala Sedang

1. Inokulasi

Kultur bakteri untuk preparasi plasmid ditumbuhkan dari stok gliserol ke dalam  5 ml media LB cair dengan agen seleksi tertentu (antibiotik) selama semalam. Untuk hasil yang baik, kultur bakteri ditumbuhkan dari koloni tunggal yang diambil dari koloni baru yang ditumbuhkan pada media seleksi agar. Subkultur secara langsung dari stok gliserol, atau media agar dan cair yang telah lama disimpan dapat menyebabkan hilangnya plasmid dari bakteri maupun terjadinya mutasi plasmid.

Klon yang diinginkan sebaiknya ditumbuhkan dari stok gliserol ke media seleksi agar yang dibuat baru dengan agen seleksi tertentu seperti antibiotik, untuk mendapatkan koloni tunggal. Selanjutnya, koloni tunggal diinokulasikan pada 2-10 ml media LB cair yang mengandung antibiotik tertentu dan ditumbuhkan selama lebih kurang 8 jam/ semalam. Inokulum awal tersebut kemudian diinokulasikan lagi pada media LB cair dalam Erlenmeyer (2,5-5 ml kultur awal diinokulasikan ke dalam 200 ml LB). Untuk mengkultur bakteri, gunakan wadah yang setidaknya 4 kali lebih besar dengan volume kultur. Tumbuhkan kultur dengan penggoyangan yang kuat (180-300 rpm) hingga mencapai titik jenuh (12-16 jam). Dengan waktu inkubasi 12-16 jam diperkirakan kultur berada pada transisi dari fase pertumbuhan logritmik ke fase pertumbuhan stasioner. Pada masa transisi tersebut, rasio DNA plasmid/RNA lebih besar daripada rasio saat fase logaritmik. Selain itu, DNA belum terdegradasi akibat menuanya usia kultur hingga akhir fase stasioner.

Untuk low copy plasmid, penambahan kloramfenikol dilakukan seteleh kultur mencapai OD600 = 1.0 dan kultur dilanjutkan hingga 12-16 jam. Penambahan kloramfenikol bertujuan untuk menghambat pertumbuhan bakteri dan meningkatkan jumlah replikasi plasmid dalam bakteri inang. Pekerjaan bisa dilakukan dengan mudah dengan menumbuhkan inokulum awal pada LB cair sepanjang hari dan menumbuhkan pada kultur skala lebih besar selama semalam untuk dipanen keesokan harinya.

2. Panen sel

Sel bakteri dipanen dengan sentrifugasi 6000 rpm selama 15 menit pada 4°C (Nalgene tube, Beckman JA-10). Media kultur dibuang dengan menuangnya dari tabung sentrifus hingga semua media terbuang. Vortex endapan bakteri hingga terdispersi sebelum menambahkan larutan buffer. Jika akan melanjutkan tahap isolasi pada lain waktu, bakteri dapat disimpan pada -20°C.

B. Isolasi DNA plasmid dengan Qiagen Midi kit

Dinginkan buffer P3 pada 4°C dan siapkan es.

ß

Resuspen endapan bakteri dalam 5 ml buffer P1.

ß

Tambahkan 5 ml buffer P2,

homogenkan secara perlahan dengan membolak-balik tabung 4-6 kali untuk menghindari rusaknya DNA genomik

ß

inkubasi pada suhu ruangan selama 5 menit (jangan kelamaan).

ß

Tambahkan 5 ml buffer P3 dingin,

homogenkan secara perlahan dengan membolak-balik tabung 4-6 kali.

ß

Inkubasi dalam es selama 15 menit.

ß

Sentrifus 20.000 g (12.000 rpm pada rotor Beckman JA-17;

13.000 rpm pada Sorvall SS-34) selama 30 menit pada 4°C pada tabung polipropilen (jangan gunakan tabung kaca).

Setelah sentrifugasi, supernatan harus terlihat jernih.

ß

Pindahkan supernatan yang mengandung DNA plasmid pada tabung baru (A),

sentrifus kembali 20.000 g selama 15 menit pada 4°C.

ß

Pindahkan supernatan yang mengandung DNA plasmid pada tabung baru (B).

ß

Setimbangkan QIAGEN-tip 100 dengan menuangkan 5 ml buffer QBT,

kosongkan kembali isi kolom dengan membiarkan

buffer menetes dengan bantuan gravitasi.

ß

Tuangkan supernatan yang mengandung DNA plasmid (B) ke dalam QIAGEN-tip dan biarkan cairan memasuki resin.

ß

Cuci QIAGEN-tip dengan mengalirkan 2×15 ml buffer QC.

ß

Siapkan tabung untuk menampung eluat berisi DNA plasmid.

Jangan gunakan tabung polikarbonat.

ß

Elusi DNA dengan menggunakan 7 ml buffer QF.

ß

Endapkan DNA dengan menambahkan 5 ml (0,7 volume) isopropanol.

Homogenkan dan sentrifus segera pada 15.000 g (~12.000 rpm) selama 30 menit

atau pada 5.000 g selama 1 jam pada suhu 4C.

ß

Buang supernatan secara hati-hati.

ß

Cuci pellet dengan 2,5 ml etanol 70%,

sentrifus pada 15.000 g (~12.000 rpm) selama 10 menit

atau pada 5.000 g selama 1 jam pada suhu 4C.

ß

Keringkan pellet pada udara terbuka selama 5-10 menit.

ß

Larutkan dengan ~120 ul buffer TE pH 8.0.

(Tambahkan buffer TE, goyangkan hingga membasahi pellet, diamkan semalam pada 4C, larutkan secara sempurna keesokan harinya. Hindari resuspensi dengan vortex atau pemipetan secara berlebihan).

ß

Tentukan konsentrasi dan kemurnian DNA dengan spektrofotometer pada 260/280 nm

(Volume pengukuran @ 200 ul.

Lakukan pengenceran 20 kali (10 ul dalam 200 ul) – 100 kali (2 ul dalam 200 ul).)

OD260 DNA = 1.0 pada konsentrasi 0,05 ug/ul

ß

Lakukan elektroforesis dengan mengaplikasikan 0,3-1 ug DNA pada gel agarose 1%.

Perhatikan pita akibat kontaminasi DNA genomik dan RNA.

Catatan:

  • Untuk melisis sel bakteri secara efeisien, gunakan tabung yang cukup besar untuk dapat mencampur buffer lisis P1 secara homogen. Pastikan bahwa RNase A sudah ditambahkan pada buffer P1. Bakteri harus diresuspen secara sempurna hingga tidak terdapat gumpalan sel lagi.
  • Setelah menambahkan buffer P2, jangan memvortex karena akan merusak DNA genomik yang akan menimbulkan kontaminasi pada DNA plasmid (muncul pita ~23.000 kb). Setelah penambahan buffer P2, lisat terlihat viskus/ kental. Setelah digunakan, tutup segera botol buffer P2 untuk menghindari reaksi asam dengan CO2 dari udara.
  • Setelah penambahan buffer P3, akan terlihat gumpalan-gumpalan putih melayang-layang dan lisat menjadi kurang kental. Gumpalan tersebut mengandung DNA genomik, protein, debris sel, dan SDS. Lisat harus dihomogenkan secara sempurna untuk memastikan pengendapan yang sempurna oleh SDS. Jika campuran masih terlihat kental dan kecoklatan, diperlukan pencampuran kembali untuk menetralkan larutan secara sempurna.
  • Pellet isopropanol memiliki penampakan seperti kaca sehingga lebih sulit dilihat daripada pellet yang dihasilkan dari presipitasi etanol. Selain itu, pellet isorpopanol lebih mudah terlepas dari dinding tabung. Mengeringkan pellet sehingga terlalu kering mengakibatkan pellet susah terlarut. DNA akan terlarut dengan baik dalam kondisi sedikit alkalis dan tidak mudah larut dalam kondisi asam. Kapasitas QIAGEN-tip 100 = 75-100 ug DNA.

April 2010

<XEPT>

Advertisements

Leave a Reply

Fill in your details below or click an icon to log in:

WordPress.com Logo

You are commenting using your WordPress.com account. Log Out / Change )

Twitter picture

You are commenting using your Twitter account. Log Out / Change )

Facebook photo

You are commenting using your Facebook account. Log Out / Change )

Google+ photo

You are commenting using your Google+ account. Log Out / Change )

Connecting to %s

%d bloggers like this: